二手液相色譜 法之 手性色譜法
不少有機(jī)藥物的結(jié)構(gòu)中有不對(duì)稱(chēng)碳原子，又稱(chēng)手性碳原子，有手性碳原子的藥物具有旋光性。立體構(gòu)型不同的一對(duì)對(duì)映體，其藥效、毒副作用往往不相同。例如抗高血壓藥物a -甲基多巴是S-(-)體;又如氯霉素(含有二個(gè)手性碳原子)，只有D-(-)異構(gòu)體有效。而L-(+)異構(gòu)體完全無(wú)效。沙利度胺(反應(yīng)停)的兩個(gè)對(duì)映體對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜作用的效價(jià)相近，但只有左旋異構(gòu)體才有胚胎毒及致畸作用。因此，對(duì)映體的分離，在藥物的制備和質(zhì)量控制方面，都具有重要的意義。對(duì)映體在普通條件下的理化性質(zhì)是相同的，因此分離對(duì)映體需要在手性條件下進(jìn)行。分離對(duì)映體的色譜方法稱(chēng)為手性色譜法。二手液相色譜法之手性色譜法分為間接法和直接法兩種。間接法是將對(duì)映體與一定的手性衍生化試劑反應(yīng)，使其由對(duì)映體轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映體，再利用他們理化性質(zhì)的差異，用-般的色譜條件進(jìn)行分離。直接法不需作衍生化反應(yīng)，直接利用手性色譜柱或手性流動(dòng)相進(jìn)行分離，應(yīng)用較多，以下主要介紹二手液相色譜法之手性色譜法的直接法。

1手性固定相
手性藥物拆分前的對(duì)映體通常以鏡象存在，即以外消旋體形式存在。用常規(guī)分析和制備方法不能將其拆分，需引入不對(duì)稱(chēng)( 即手性)環(huán)境，使欲拆分的對(duì)映體(樣品)、 手性作用物(比如固定相)和手性源形成一個(gè)非對(duì)映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。為了形成這樣一種分子絡(luò)合物，分子之間要有-種同時(shí)相互存在的作用力，以保持分子的空間定位。Dalgliesh 認(rèn)為至少要有三個(gè)作用力，其中一個(gè)要有立體選擇性，可以是吸引的，也可以是排斥的。這就是“三點(diǎn)相互作用”理論。如果對(duì)映體中某一種對(duì)映體正好與此三個(gè)作用點(diǎn)配對(duì)，相互作用較強(qiáng)，保留時(shí)間就長(zhǎng)。而另一種對(duì)映體因空間構(gòu)成不同，不能完全配對(duì)，作用相對(duì)較弱，保留時(shí)間就短，從而可以得到分離。固定相的作用可以是氫鍵、偶極一偶極作用、π_π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用等。
常用的手性固定相有以下幾種：
(1)Pirkle型手性固定相
Pickle型手性固定相是由美國(guó)學(xué)者Pirkle主持研制的，主要有π -堿性(斥電子基)手性固定相和π酸性(吸電子基)手性固定相。在分離的過(guò)程中，化合物與固定相之間發(fā)生π-π電荷轉(zhuǎn)移相互作用，此類(lèi)固定相為電荷轉(zhuǎn)移型手性固定相。如DNBPG-CSP是把(R)-N3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸( dinitrobenzy1 phenylglycin) 鍵合到氨丙基硅膠上。
(2)蛋白質(zhì)類(lèi)手性因定相
蛋白質(zhì)是由手性亞基團(tuán)氨基酸組成的大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相是將蛋白質(zhì)通過(guò)氨基酸鍵合到硅膠上而制成的。常用的蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相有牛血清蛋白(RSA)和人血a1-酸性糖蛋白(AGP) 的手性固定相，商品有Chiral AGP, Resolvosil, Enantio Pac等 。蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相應(yīng)用范圍較廣，效果良好，但該類(lèi)固定相的譜柱容里較小。常用洗脫系統(tǒng)是磷酸鹽緩沖溶液(PH4~7)， 離子強(qiáng)度為0~ 500mmol,有機(jī)改性劑不得超過(guò)5%。用蛋白質(zhì)類(lèi)手性固定相拆分酸性和堿性?xún)A倒物對(duì)映體時(shí)，流動(dòng)相內(nèi)可分別加少童離子對(duì)試劑，如.N,N-二甲基辛胺，叔丁胺氫溴酸鹽和辛酸，以獲得理想的分離結(jié)果。
(3)多糖類(lèi)手性固定相
多糖類(lèi)手性固定相中應(yīng)用最多的是環(huán)糊精。環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)是一類(lèi)環(huán)形寡聚糖，為手性高分子物質(zhì)，根據(jù)分子中葡萄糖單元的個(gè)數(shù)不同，環(huán)糊精可分為a、β、γ三類(lèi)，他們分別由6、7、8個(gè)D_吡喃葡萄糖組成，將CD分別通過(guò)硅烷鏈連接在硅膠表面就構(gòu)成環(huán)糊精手性固定相。環(huán)糊精分子成錐桶狀，內(nèi)腔的直徑由組成環(huán)糊精的葡萄糖個(gè)數(shù)決定，如常用的_環(huán)糊精由7個(gè)葡萄糖分子組成，內(nèi)腔直徑為0.8nm。用環(huán)糊精手性固定相進(jìn)行分離時(shí)，首先要求被拆分的組分進(jìn)人洞穴，形成包合物，保留時(shí)間以組分能否進(jìn)人洞穴及其緊密的程度而定，環(huán)糊精環(huán)上還有多個(gè)手性中心，能選擇性地與對(duì)映體作用，從而導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體的保留不同而被分離。如用β-環(huán)糊精手性固定相已經(jīng)成功地分離了二茂鐵等金屬有機(jī)絡(luò)合物、氨基酸以及生物堿等。除環(huán)糊精外，多糖類(lèi)的手性固定相還可以用纖維素、直鏈淀粉作成，如纖維素三醋酸醋手性固定相、纖維素三苯甲酸醋手性固定相和纖維素氨基甲酸酯手性固定相等。
(4)冠醚(Grown ether) 類(lèi)手性固定相.
冠醚與環(huán)糊精類(lèi)似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚鍵的環(huán)狀化合物，呈王冠狀結(jié)構(gòu)，外層是親脂性的乙撐基，環(huán)的內(nèi)層是富電子的雜原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙煒骨架或硅膠上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分離對(duì)映體時(shí)，不同對(duì)映異構(gòu)體因與冠醚環(huán)腔形成的主客體絡(luò)合物的穩(wěn)定性不同而被分離。在冠醚上引人雙萘基，雙萘基可以形成“手性墻”增加固定相的立體選擇性。能質(zhì)子化的氨基化合物，特別是氨基酸對(duì)映體在冠醚手性固定相上可以得到很好的分離。

  2.手性流動(dòng)相拆分法
手性流動(dòng)相拆分法是將手性試劑添加到流動(dòng)相中，利用手性試劑與對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同或結(jié)合物在固定相上分配的差異進(jìn)行分離。近年來(lái)，手性流動(dòng)相拆分法已廣泛應(yīng)用于藥物對(duì)映體的拆分。此法的最大優(yōu)勢(shì)在于:可采用普通的非手性固定相，不需對(duì)樣品.進(jìn)行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更換，同時(shí)添加物的可變范圍較寬，穩(wěn)定性好，且價(jià)格便宜。
(1)配體交換型手性添加劑
配體交換型手性添加劑由手性配基和含二價(jià)金屬離子的鹽組成o手性配基多為具有光學(xué)活性的氨基酸及其衍生物，他們和二價(jià)金屬離子螯合，分布于流動(dòng)相中，遇到待分離的對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，即形成配合物，再在流動(dòng)相和固定相之間分配而實(shí)現(xiàn)分離。分離的機(jī)理-般認(rèn)為.是配基和金屬離子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成動(dòng)態(tài)的手性固定相而發(fā)揮作用。也可以看成是手性配基、金屬離子和對(duì)映異構(gòu)體形成的配合物穩(wěn)定常數(shù)不同而產(chǎn)生分離o采用5µm粒徑的C18固定相，阿司帕坦作為CMPA，與硫酸銅絡(luò)合，測(cè)定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的濃度。
(2)環(huán)糊精添加劑
環(huán)糊精在水中有-定的溶解度，用環(huán)糊精作為手性添加劑，加入流動(dòng)相中，其分離機(jī)理與環(huán)糊精手性固定相相同,但保留行為正好相反。對(duì)映異構(gòu)體與環(huán)糊精形成的包合物穩(wěn)定性越強(qiáng)，隨流動(dòng)相出柱越快，保留時(shí)間越短。
(3)手性離于對(duì)添加劑
解離的有機(jī)化合物能與含互補(bǔ)電荷的試劑相互作用，生成電中性離子對(duì)。分離帶電荷的對(duì)映異構(gòu)體時(shí)，可以在流動(dòng)相中添加手性的離子對(duì)試劑，對(duì)映異構(gòu)體和離子對(duì)試劑形成電中性的離子對(duì),離子對(duì)在固定相和流動(dòng)相間分配系數(shù)不同而得到分離。常用的手性離子對(duì)試劑有(+)10-樟腦磺酸、奎寧等。